연구분야

'미백(skin whitening)'이란 용어는 일본에서 60~70년대에 처음으로 등장한 개념으로 화장품에 특정 미백성분을 사용함으로써 얼굴색을 밝고 화사하게 할 수 있다는 의미로 사용되었습니다.
피부색은 피부에 존재하는 멜라닌(melanin)에 의해 결정되는데 통상적으로 멜라닌이 많이지면 피부가 검게 보입니다.
피부 미백제는 멜라닌의 합성을 줄이고 멜라닌의 분포를 고르게 하거나 각질형성 세포로의 멜라닌 전달을 저해 할 수 있는 물질로서 피부에 사용 시 피부를 밝고 희게 할 수 있는 물질로 정의됩니다.

<평가방법>
멜라닌 생성을 억제하는 미백성분의 연구방법으로는 tyrosinase 활성 저해 실험, 배양 멜라닌 세포를 이용한 실험, 실험동물에서의 생체실험, 사람 피부를 대상으로 한 실험 등이 실시되고 있습니다. 이 중 멜라닌 합성의 주 효소인 tyrosinase 활성 저해 실험이 멜라닌 중합체 억제제 개발의 초기 단계에서 주로 채택되고 있습니다.
Tyrosinase는 미생물, 식물 및 동물 등 거의 모든 생물 종에 분포되어 있는 단백질 종류입니다. 동물 조직에서 멜라닌 색소의 형성에 관여하기 때문에 tyrosinase 활성 저해 평가를 통해 미백 효과를 검증 할 수 있습니다.

망고 잎을 활용한 제품 개발 연구(발효와 비발효) MLE : 망고 잎 추출물
MLFE : 망고 잎 유산균발효 추출물
MEFE : 망고 잎 EM발효 추출물

Tyrosinase 저해활성 실험결과 망고 잎 추출물에서
미백 효과가 높은 것을 알 수 있다.

활성산소는 우리 몸에 꼭 필요한 영양소와 세포를 파괴하여 문제를 일으킵니다. 몸속의 아미노산을 산화시켜 단백질의 기능저하를 가져오거나 핵산을 손상시켜, 다양한 문제를 발생시켜 돌연변이나 암의 원인이 되고 때에 따라서는 각종 질병과 노화의 원인이 됩니다.
항산화 활성이라는 것은 산화를 억제하는 것을 의미하는데, 노화하는 것은 세포의 산화가 한 이유입니다.
즉, 항산화효과는 활성산소의 산화활동을 억제하거나 제거하는 효과를 말합니다.

<평가방법>
- 활성산소종(ROS) 제거능
망고잎의 ROS제거능 실험결과 활성산소 소거능이 우수하여
항산화 효과가 높은 것을 알 수 있다. - DPPH 소거 활성 측정
DPPH assay는 노화의 원인이 되는 라디칼의 소거정도로 특정 물질의 항산화효과를 알아보는 실험법입니다.
DPPH는 그 자체가 매우 안전한 수용성 free radical로서 517nm에서 특징적인 광흡수를 나타내는 보라색 화합물입니다.
이 radical은 알코올 등의 유기용매에서 매우 안정하며 항산화 활성이 있는 물질과 만나면 전자를 내어주면서 라디칼(DPPH)이 소멸되어서 처음의 보라색빛깔에서 노란색으로 색이 변하게 되어 항산화 활성을 육안으로도 쉽게 관찰할 수 있는 장점이 있습니다.

망고 잎의 비 발효 추출물과 발효추출물의 항산화효과 측정
전자공여능을 측정한 결과 농도가 증가함에 따라 추출물의 항산화 활성이 증가되었으며, 합성 항산화제인 BHT와 같은 농도에서 비교하였을 때 더 높은 활성을 나타냈다.

세포의 수나 성장, 세포막의 유지, 생합성 과정이나 효소활성에 미치는 영향을 조사합니다.
MTT assay는 생명과학분야에서 세포의 증식을 정확하고 신속하게 결정할 수 있는 실험실 시험법입니다.

<평가방법>
- 세포 생존율(MTT assay)
MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide) 분석을 통한 세포 독성 측정

MTT assay는 탈수소 효소작용에 의하여 노란색의 수용성 기질인 MTT tetrazolium을 청자색을 띄는 비수용성의 MTT formazan (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide)으로 환원시키는 미토콘드리아의 능력을 이용하는 검사법이다.
미토콘드리아는 전자전달을 통해 세포에 에너지를 공급하는 세포내 소기관이다. MTT 독성 분석은 미토콘드리아내의 전자전달 활성을 측정하여 세포 독성을 측정한다.
MTT, WST, XTT 등을 포함하는 테트라졸리움(tetrazolium)은 세포 내의 환원효소에 의해 쉽게 환원되어 색깔변화를 나타내게 된다. 살아있는 세포에 노란색의 테트라졸리움 염인 MTT를 처리하게 되면, 미토콘드리아내 전자 전달계에 존재하는 환원효소가 이를 환원하여 청자색을 띠는 포마잔(formazan)이라고 불리는 결정을 형성한다.
즉, 포마잔의 형성량은 미토콘드리아의 전자전달능력 혹은 세포의 활성 정도와 비례한다고 할 수 있다.

MLE : 망고 잎 추출물
MLFE : 망고 잎 유산균발효 추출물
MEFE : 망고 잎 EM발효 추출물

RAW 264.7 cells 에서 망고 잎의 각 농도별에서
발효추출물은 세포독성에 비교적 안정적으로 나타났다.

염증반응은 생체나 조직에 물리적 작용이나 화학적 물질, 세균감염 등의 기질적 변화를 가쳐오는 침습에 의하여 그 손상부위를 수복 재생하려는 기전이며, 일단 자극이 가해지면 국소적으로 혈관 활성 물질(Histamine, serotonine, leukotirene 등)이 유리되어 혈관 투과성이 증대되면서 염증을 유발한다. 이러한 염증반응 손상부분에 대한 복구를 어렵게 하여 주위 세포에 위해를 가하여 주변 조직에 대한 방어력을 떨어뜨리게 됨으로 함염증 반응을 통해 방어가 필요하다.

<평가방법>
○ RT-PCR

역전사 중합효소 연쇄반응(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction)은 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction)의 변형으로, '증폭'이라 불리는 과정을 통해 많은 수의 DNA 서열을 만들기 위해 분자생물학에서 일반적으로 사용하는 기법

○ LPS

내독소로 잘 알려진 Lipopolysaccaride(LPS)는 그람-음성균의 세포외막에 존재하며, RAW264.7와 같은 Macrophage 또는 monocyte에서 IL-1β, IL-6, TNF-α 등과 같은 pro-inflammatory cytokine을 증가시키는 것으로 알려진다.

○ RT-PCR 실험방법

24 well plate에 5×10⁵cell/cm³의 농도로 파종된 264.7 세포에 1㎍/mL LPS로 24시간 동안 처리 후 추출물을 넣고 12시간 동안 배양한다. 그리고 난 다음 배양된 세포의 배양액을 제거하고 1mL의 Trizol(Invitrogen, Life Technologies Co, Groningen, Netherlands)과 0.2mL의 Chloroform을 처리하여 세포에서 RNA층을 분리하였고 상층액을 취하여 Isoamyl alcohol(Sigma-Aldrich) 0.5mL을 넣고, Polyacryl CarrierTM(Molecules Research Center, INC., Cincinnati, OH, USA)를 5㎕ 넣어 RNA를 침전시킨다. 분리된 RNA를 Oligo(dT) primer(Daejeon, Korea, Genotech) (Invitrogen), 5×first strand buffer (Invitrogen), dNTP (dGTP, dATP, dCTP, Gibco), RNase inhibitor (Invitrogen), SuperScript II RT (Invitorigen), RNase H Reverse Transcriptase (Invitrogen), DNase/RNase free water (Gibco)를 첨가하여 Authorized thermal cycler (TP600, Takara Bio Inc, Japan)를 통하여 cDNA로 Reverse Transcriptase 하였다. 이렇게 Transcriptase 시킨 cDNA는 2unit Taq DAN Polymerase를 포함한 PCR master kit (Roche, Germany)를 이용하여 primer (IL-1β)를 신장시켜 원하는 DNA의 특정 영역을 증폭시켰다.
PCR 후 증폭된 DNA를 Ethidium bormide solution (Sigma)이 포함된 1.2%(w/v) Agarose Gel (sigma)에 Electrophoresis을 수행한 후 상대적 발현을 시각화하여 300nm 자외선 투과조사기 (Vilber Lourmat ETX-20.M, France)로 촬영하여 밴드의 발현정도를 관찰

○ ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent assay

효소 면역정량법으로 항체를 이용하여 샘플 속 원하는 물질을 정성 및 정량 분석한다.


○ ELISA 측정 실험방법

RAW264.7 세포 주에 96-well plate에 2.5×10⁵/mL로 0.2mL씩 분주하고 24시간 동안 sub-culture한 후 농도별 추출물(50, 100, 200㎍/mL)과 양성대조군으로 cyclosporin A (CsA, 10㎍/mL)를 처리하고 1시간 후에 LPS (1㎍/mL)으로 자극한 뒤 16시간 후에 세포배양액을 얻었다. Mouse-IL-6,TNF-α (eBioscience, USA) ELISA kit를 사용하여 제조사의 지시에 따라 코팅 antibody를 microwell에 100㎕씩 분주하고 4℃에서 16시간 두었으며 각 well을 wash buffer로 세척하고 assay diluent를 200㎕씩 넣어서 1시간 동안 well을 막은 후 실온에서 배양하였다. 표준 품을 희석하고 상청 액을 20배 희석한 후 microplate를 세척하고 각 표준품과 상청액을 100㎕씩 넣었으며 2시간 동안 well을 막은 후 실온에서 배양하였다. Microplate를 세척하고 working detector를 만들어서 각 well에 100㎕씩 넣고 30분 동안 어두운 곳에서 실온으로 배양하였다. Stop solution을 각 well에 50㎕씩 넣고 microplate spectrophotometer에서 흡광도 450nm로 측정

염증 반응 발현에 영향을 미치는 IL-1β, COX-2, IL-6, NOS-II, TNF-α의 유전자 발현억제를 음성대조군(LPS-CT)과 양성대조군(LPS-CsA)으로 비교 하여 본 결과 위의 Fig와 같은 결과를 확인 할 수 있었다. 용매에 따른 추출방법에 따라 그 억제 효과가 각기 다르게 나타났으며, 발효 방법에 따라서도 억제 효과가 다르게 나타났다.

본 연구는 나노캡슐레이션의 계피 및 라이코펜 추출물과 이들을 내포한 천연복합물질이(KSMT) 구속 스트레스 유발 마우스의 산화적 스트레스에 미치는 영향을 입증하기 위한 실험입니다.

<평가방법>
온도 20.3 ~ 23.7℃, 상대 습도 40.4 ~ 55.6%의 외부적인 환경을 24시간 유지하고, C57BL/6 Mouse의 등 부위를 제모한 후 4주 동안 Minoxidil, KSMT, 신남 알데히드, β-이오논군을 도포했다. 그리고 구속 스트레스를 통하여 육안적, 조직학적인 변화 관찰을 통한 육모 촉진 효과를 확인하였으며, 항산화 측정을 위해 MDA, GPx, SOD, CAT 효소 활성을 비교했다.

실험 결과 구속 스트레스로 인하여 산화 스트레스의 지표 성분인 MDA(Malondialdehyde) 함량이 일반 Control군 대비 유의적으로 높게 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 또한 극심한 스트레스로 생성된 활성산소를 감소시켜주는 항산화 효소의 활성을 측정한 결과 Control군, Stress군 대비 Minoxidil, KSMT를 처리한 군에서 유의적으로 높게 나타나 생체 내 항산화 효소의 활성을 높이는 효능을 확인하였다.

발모/양모능 측정 실험에서는 이미 선행 연구로 발모 효능이 입증된 Minoxidil과 비교 시, 신남 알데히드, β-이오논과 기능성 소재 추출물이 함유된 KSMT 실험군에서 모발의 성장 속도가 더욱 촉진되었고, 모발의 분포 및 성숙도에서 높은 증강 효과를 보였다.

이상과 같은 실험 결과를 토대로 의뢰 시험 물질인 KSMT, 신남 알데히드, β-이오논 시료 중, KSMT 실험 물질은 구속에 의한 산화적 스트레스 시험 모델에서 발모를 유의적으로 증가시키며, 이러한 발모/양모 효능은 생체 내 항산화 효소의 활성을 도와 구속에 의한 산화 스트레스를 경감시키는 데 효과가 있다고 할 수 있다.

○ 체중 변화 및 장기 무게

○ 혈액 내 주요 항산화 효소 및 MDA 함량 비교 분석

○ 발모 상태의 육안적·형태학적 변화

- Control 및 Stress군 대비 Minoxidil, KSMT를 도포한 군에서 육안으로 hair re-growth가 확연하게 개선됨을 확인
- Control군에서 일정 사이즈의 모낭을 관찰할 수 있었으나 구속 스트레스 통해 모낭의 형성, 분포, 성숙도가 확연히 떨어졌음. 그러나 Minoxidil군과 KSMT군의 경우, 진피층에서부터 모낭이 형성되어 성숙해지는 것을 관찰할 수 있었으며 모낭의 분포 및 성장도 뛰어난 효과를 보여줌을 확인

본 기술은 라이코펜의 핵심 성분인 베타이오논과 계피의 핵심 성분인 신남알데하이드를 각각 포접시켜 나노캡슐화 함으로써, 4~6mm 깊이의 모공 속까지 유효성분 침투를 유도해 모근 세포 활성화 및 탈모 방지 기능을 높이고자 했습니다.

<평가방법>
본 연구에서는 경피 흡수 촉진 방법 중 안정성 및 세포 조직 투과성 기능을 가진 나노 캡슐화 방법을 응용하여 탈모 유발균인 P.acnes균에 항균 효과가 있는 천연 소재 계피 추출물을 코어 물질로 나노 캡슐화하여 약 6mm의 길이인 모낭 속으로 운반 전달 시스템을 적용해 두피를 건강하게 하고 탈모를 방지하는 기능성 화장품 소재를 개발하고 분석하였다.

계피 추출 방법으로는 에탄올을 이용한 감압농축 추출법을 사용하였다. 그리고 계피 추출물을 함유한 나노 캡슐의 입자 크기를 동적광산란(Dynamic Light Scattering, DLS)으로 분석하였다. 분석 결과, 계피 추출믈의 총량을 2~15%로 변화시켰을 때 2%의 계피 추출물을 함유한 나노 캡슐의 입자 크기가 약 100nm로 가장 작은 크기를 나타내었고, 계피 추출물의 함량이 증가될수록 나노 캡슐의 입자 크기가 점점 커지는 경향을 확인하였다.

또한 감압농축법을 이용하여 추출한 80% 에탄올 계피 추출물을 약 2달간 paper disk법으로 항균성을 측정한 결과, 시간이 경과할수록 계피 입자의 크기가 증가하였고, 입자 크기가 증가할수록 항균성이 떨어지는 것을 확인하였다. 또한 계피 추출물을 냉장 보관한 것이 실온 보관한 것보다 계피 추출물 입자의 크기가 작았고, 그에 따라 상대적으로 더 높은 항균 성능을 나타냈다.

<기술개발 과정: 활성 단일물질 분리 및 캡슐화 실험> DLS 입도분석 & FE-SEM 분석

○ 원료표준화(활성 단일물질 분리) LC-MS를 이용하여 활성 단일물질 분리 확인

○ 원료표준화(활성 단일물질 분리) LC-MS를 이용하여 활성 단일물질 분리 확인

○ pH 범위 및 중금속 시험서

○ 잔류 농약 및 세포 독성(MTT assay) 실험 평가

○ 단일 물질 포함한 두피 제품 안정성 실험 가혹시험 60℃에서 3시간이상 물성 변화 없음